Раствор бриллиантового зелёного используется в качестве антисептического лекарственного средства (в США и Европейском союзе в качестве антисептика разрешён, но практически не применяется), а также для обеззараживания медицинских инструментов. В качестве лекарственного средства используется в виде от 0,05 % до 2 % водного или спиртового раствора (на 60%м этаноле)
Показан к применению для обеззараживания свежих послеоперационных и посттравматических рубцов, пуповины новорождённых, ссадин, порезов, иных нарушений целостности кожных покровов, при лечении гнойно-воспалительных процессов кожи — гордеолума(«ячмень»), блефарида, фурункулёза, карбункулёза местной стафилококковой инфекции. Применяется наружно, препарат наносят на повреждённую поверхность, захватывая окружающие здоровые ткани
Бриллиантовый зелёный является одним из самых высокоактивных и быстродействующих антисептиков ,также оказывает фунгицидное действие в отношении некоторых патогенных грибов. В присутствии органических веществ противомикробная активность снижается: при оценке активности этого красителя в среде, содержащей 10 % сыворотки крови, феноловый коэффициент равен 120 (0,3 % от величины в водной среде)
Также применяется в ветеринарии.